來自美國Jackson實驗室、中國科學院動物研究所和辛辛那提大學的研究人員報告稱，他們通過組合CRISPR-Cas9和PumilioRNA結合蛋白，構建出了一種可用于基因調控及基因組標記的萬能系統(tǒng)，他們將之命名為Casilio系統(tǒng)。
中國科學院動物研究所基因工程技術研究組組長王皓毅(HaoyiWang)研究員，及任職于Jackson實驗室和辛辛那提大學的AlbertWCheng是這篇論文的共同通訊作者。
由于其簡易及有效，近年來CRISPR-Cas9系統(tǒng)被廣泛用于基因組編輯。核酸酶缺陷突變體dCas9蛋白可以與一些效應結構域進行融合，這樣的融合蛋白可由sgRNAs引導至基因組位點來調控基因表達或標記染色體。
例如，在2013年，華人科學家齊磊（LeiS.Qi，音譯）就開發(fā)出了一種稱作為CRISPR干擾（CRISPRi）的系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，是將缺失核酸內(nèi)切酶活性的Cas9與一種導向RNA共表達，由此產(chǎn)生一種DNA識別復合物，這種復合物能特異性干擾轉錄延伸，RNA聚合酶結合，或轉錄因子結合。這種RNA導向的DNA識別平臺是基因組范圍內(nèi)基因表達選擇性抑制的一種簡單的新方法（延伸閱讀：華裔博士連發(fā)Cell，Nature：基因沉默新技術）。
然而，由于獨特的sgRNA:Cas9配對，在大多數(shù)這樣的實驗中只能應用一種類型的效應蛋白。直接融合多個拷貝的效應蛋白與dCas9來獲得充分的效應蛋白活性存在著技術挑戰(zhàn)。結合利用MS2和PP7一類病毒RNA序列的RNA適配子方法與CRISPR-Cas9系統(tǒng)為提高多路復用性及多聚化提供了工具，但當前只有有限數(shù)量充分確定特征的RNA適配子。并且，將三個或以上拷貝的這些結構化適配子整合到sgRNA上會降低sgRNA表達，由此限制了可招募效應蛋白的數(shù)量。
在這篇文章中研究人員報告通過組合CRISPR-Cas9和PumilioRNA結合蛋白建立了Casilio系統(tǒng)。Pumilio和FBF蛋白都具有一個保守的Pumilio/FBF(PUF)RNA結合結構域??這一結構域可編程來結合一種特異的8-merRNA序列（PUF結合位點，PBS）。這一Casilio系統(tǒng)是由dCas9蛋白，附帶有一個或以上PUF結合位點的一條sgRNA(sgRNA-PBS)，和與PUF結構域融合的一個效應蛋白（PUF融合蛋白）所構成。
研究人員證實這一Casilio系統(tǒng)可實現(xiàn)轉錄調控因子，表觀遺傳修飾蛋白及熒光蛋白在定義基因組位點上的多路復用及多聚化。Casilio系統(tǒng)的主要優(yōu)點包括有：(I)多路復用性�？赏瑫r將不同的Casilio模塊傳送到細胞中，每個模塊可在定義靶位點上運作，獨立發(fā)揮作用。由于可以很容易地編程PUF結構域來識別所有8-merRNA模體，這樣大大擴展了獨立Casilio模體的潛在數(shù)量。
(II)多聚化。線性8-merPBS模體簡易性可實現(xiàn)sgRNA-PBS上廣泛的PUF融合蛋白多聚化，且不會阻礙sgRNA轉錄或dCas9/sgRNADNA結合活性。這一特征使得能夠將多個PUF融合蛋白分子組裝到sgRNA上，在局部集中效應蛋白或蛋白質標記。這對于熒光成像或轉錄調控尤其有用。
(III)復合物形成。通過進一步的開發(fā)和優(yōu)化，sgRNA-PBS有潛力成為PUF引導組裝化學計量確定的蛋白質復合物的一個RNA支架。
考慮到這些優(yōu)點，作者們表示相信這一Casilio系統(tǒng)將為研究基因功能和染色質結構的一種強大工具。
王皓毅在麻省理工學院RudolfJaenisch實驗室進行博士后研究時就曾參與了CRISPR技術的早期開發(fā)，近年來發(fā)表了一系列介紹CRISPR技術的重要文章。
此前，在《MammGenome》雜志上發(fā)表的一篇文章中，王皓毅研究員和合著者們不僅簡要地為我們概述了這一快速發(fā)展的領域，介紹了CRISPR?Cas9系統(tǒng)以及它在基因組編輯中的應用，還著重介紹了設計CRISPR/Cas9向導RNA(guideRNA,gRNAs)的基本要點，減少脫靶效應的策略，利用CRISPR/Cas9構建小鼠模型的基本策略和注意事項，以及CRISPR/Cas9當前面臨的一些挑戰(zhàn)以及未來的發(fā)展。
在發(fā)表于《Genetics》雜志上的另一篇研究論文中，王皓毅研究員證實利用電流來傳送CRISPR/Cas9系統(tǒng)，不僅使得CRISPR/Cas9能夠高效地實現(xiàn)實驗室小鼠遺傳改造，并且可顯著提高這一系統(tǒng)的通量）。
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